05 enero, 2012

Científicos hallan proteína de interferencia en microorganismo halófilo

Reconocen secuencias específicas de siete nucleótidos para silenciar la expresión del gen.

haloquadratum_walsbyi

Hace algunos días vimos un video muy didáctico de lo que es un ARN de interferencia (ARNi). Los ARNi han sido ampliamente estudiados desde su descubrimiento en 1998 por Andrew Fire y Craig Mello, el cual les valió el Nobel de Fisiología en el 2006. Su función es regular la expresión de los genes después de que hayan sido transcritos de ADN a ARN mensajero (ARNm), en otras palabras, “apagan” o “silencian” determinados genes.

Están compuestos por unos cuantos nucleótidos —entre 21 y 23 la mayoría de las veces— que son complementarios a una región específica del ARNm, emparejándose con ellos y formando una porción de doble hebra que es degradada rápidamente por las nucleasas de la célula. 

Sin embargo, los ARNi no serían los únicos encargados de silenciar los genes a este nivel ya que un grupo de investigadores estadounidenses del Robert Wood Johnson Medical School, liderados por el Dr. Masayori Inouye, han descubierto una proteína capaz de reconocer y cortar secuencias específicas de siete nucleótidos en el ARNm con el fin de regular su expresión. Los resultados fueron publicados el 3 de Enero en Nature Communications.

Todo empezó en el 2003 cuando el mismo grupo de científicos descubrió una enzima —la MazF— en E. coli que era capaz de cortar el ARNm en regiones que portaban la secuencia ACA, silenciando así la expresión de estos genes. A estas enzimas las llamaron “interferasas”. A partir de entonces se hallaron más MazF homólogas en otras especies de bacterias, cada una con especificidades que variaban entre 3 y 5 nucleótidos.

Por ejemplo, las interferasas de Mycobacterium tuberculosis y Staphylococcus aureus reconocen secuencias específicas de cinco bases que regulan la expresión de genes asociados con su patogenicidad. No obstante, estas secuencias de reconocimiento son demasiado cortas como para silenciar la expresión de genes específicos tal como lo hacen los ARNi.

Cuando Inouye y sus colaboradores analizaron el genoma de Haloquadrata walsbyi, una arquea de forma plana y cuadrada que vive en ambientes extremadamente salinos (halófilo), encontraron un gen que codificaba una proteína homóloga a la MazF de E. coli. A este gen lo llamaron mazF-hw.

Las interferasas MazF funcionan bajo un sistema toxina-antitoxina. Esto quiere decir que hay otra proteína que regula el efecto silenciador de MazF. Esta proteína se llama MazE y los genes que los codifican están ubicados uno junto al otro (operón mazE-mazF).

En H. walsbyi también se encontró otro gen junto a mazF-hw al que llamaron mazY-hw, sin embargo la proteína que codificaba no presentaba homología con MazE.

MazY-MazFPara hacer un estudio más profundo de la interferasa MazF-hw, el Dr. Yoshihiro Yamaguchi, autor principal del estudio, aisló el gen, lo puso en un vector (pColdII-mazF-hw) que es activado en presencia de IPTG y lo introdujo en E. coli. Hizo el mismo procedimiento el otro gen (pET-mazY).

[Para entender como se hace un vector y como se inserta un gen en una bacteria mirar el video BioUnalm for dummies #2]

Al analizar el crecimiento de la E. coli transformada observó que MazF-hw era tóxico para ella (no había crecimiento) a menos que MazY estuviera presente (ver Figura C). Esto demostraba que MazY-hw y MazE cumplían la misma función a pesar de no presentar homología.

Con el fin de determinar cuál era la secuencia específica que MazF-hw reconocía, los investigadores purificaron la proteína y la estudiaron in vitro. Para ello usaron como sustrato el ARN del fago MS2 y los ARN ribosomales de bacterias (16S y 23S) y levaduras (18S y 28S). Los resultados mostraron que MazF-hw sólo cortaba el ARN del fago MS2 y lo hacía en un sólo punto. Además, cuando se ponía junto a MazY-hw, su capacidad de corte era inhibida. Esto demostraba dos cosas: i) había una secuencia de reconocimiento única en el ARN del fago que no estaba presente en los ARN ribosomales y ii) MazY-hw es la antitoxina de MazF-hw.

Usando herramientas bioinformáticas predijeron que la secuencia de reconocimiento y corte debía tener como mínimo seis bases. Las candidatas eran las secuencias UUACUC y UACUCA. Para determinar cuál era, diseñaron dos pequeñas moléculas de ARN de 13 bases donde estarían inmersas estas dos secuencias. Sin embargo, la MazF-hw no fue capaz de cortarlas. Entonces, diseñaron otras secuencias añadiendo distintos nucleótidos a cada uno de los extremos de las seis bases centrales y determinaron que la MazF-hw reconocía y cortaba una secuencia específica de siete nucleótidos (UUACUCA) y lo hacía con una especificidad superior al 99%. Además se determinó que el corte lo hacía después de la segunda U.

Las implicancias de este descubrimiento son grandes. Es la primera vez que se identifica una secuencia de reconocimiento y corte tan larga. En promedio, esta secuencia se repite cada 16,000 nucleótidos dentro de H. walsbyi, en otras palabras, no es muy frecuente y sólo estaría presente en unos pocos genes.

Al analizar los ~2,600 genes de H. walsbyi se encontró la secuencia UUACUCA en 183 de ellos: 170 presentaban una copia, 12 dos copias y sólo una presentaba tres copias de la secuencia mencionada. Como la sensibilidad del ARNm a ser cortado por la MazF-hw es proporcional al número de copias de la secuencia de reconocimiento, sólo un gen estaría fuertemente regulado por esta proteína.

El gen boa era el que presentaba las tres copias. Este gen codifica para un regulador de la bacteriorodopsina, quien es la encargada de usar la energía de la luz para bombear protones y generar ATP. Al hacer los estudios in vitro observaron que la interferasa MazF-hw era inhibida a concentraciones de 10mM de MgCl2 y 400mM de NaCl. Sin embargo estos microorganismos requieren de concentraciones de 3M de NaCl para vivir y puede resistir hasta 2M de MgCl2, lo que indicaría que MazF-hw no se encuentra activa en condiciones normales de desarrollo.

Entonces, ¿en qué momento funciona?. La H. walsbyi vive feliz flotando sobre la superficie de aguas saturadas de sales, capturando la luz del sol para producir ATP. Pero cuando los niveles de sal se reducen (estado hipo-osmótico) debido a las lluvias o el desborde de un río, las H. walsbyi pierden su capacidad de flote y se hunden, su capacidad de producir ATP se reduce porque los rayos solares no la alcanzarán con la misma eficiencia. Entonces, como la concentración de sal del entorno disminuye, la MazF-hw se activa y la bacteriorodopsina deja de ser producida (al fin y al cabo, ya no le es útil).

La activación de la MazF-hw puede desempeñar un rol importante en la respuesta de H. walsbyi a las condiciones duras del entorno: los sistemas toxina-antitoxina se caracterizan por ello. Sin embargo, aún queda otra pregunta por resolver: ¿Por qué MazF-hw fue tóxica para E. coli?

Al analizar todos los genes de E. coli se encontró la presencia de la secuencia UUACUCA en 223 de ellos, de los cuales cuatro son esenciales para su crecimiento (lolDi, rplC, rpmD y rpoB). La explicación sería que MazF-hw degrada los ARNm de estos genes evitando así que la bacteria se desarrolle.

Como conclusión tenemos que MazF-hw es una proteína que regula la expresión genética a nivel del ARNm, pero a diferencia de otras proteínas similares descritas anteriormente, su especificidad es mucho mayor, tanto así que podría regular la expresión de unos pocos gen (incluso uno sólo). Por otro lado, las interferasas no son enzimas de restricción porque no actúan a nivel del ADN.

Ahora los científicos apuntan a buscar más genes homólogos a MazF-hw, tal vez con secuencias de reconocimiento mucho más largas las cuales mejorarían enormemente su especificidad, hasta el punto de llegar a comportarse como los ARN de interferencia, los cuales reconocen secuencias de 22 bases en promedio.

Además, los investigadores apuntan al desarrollo de interferasas específicas para inactivar genes humanos que se encuentran sobreexpresados en ciertas condiciones patológicas (cánceres o enfermedades metabólicas). También se podrían diseñar interferasas que permitan bloquear el desarrollo de virus y bacterias patógenas de plantas con el fin de desarrollar variedades de cultivos resistentes a enfermedades. Sin dudas, se ha abierto un nuevo campo de investigación que espera ser aprovechado.


Referencia:

ResearchBlogging.orgYamaguchi, Y., Nariya, H., Park, J., & Inouye, M. (2012). Inhibition of specific gene expressions by protein-mediated mRNA interference Nature Communications, 3 DOI: 10.1038/ncomms1621

Imagen: H. Walsbyi (Bolhuis et al., 2004).

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