19 junio, 2012

Uso potencial de los exosomas para el tratamiento del Alzheimer

[Entrada originalmente publicada el 24 de Marzo del 2011]

Durante los últimos años, se ha avanzado mucho en el uso de pequeñas moléculas de ARN para el tratamiento de ciertas enfermedades. Estas moléculas de ARN están diseñadas para silenciar la expresión de genes involucrados con el desarrollo de la enfermedad, así que su función dependerá de que sean transportados correctamente al tejido indicado, para así evitar reacciones cruzadas con tejidos no específicos, principalmente el hígado quien es el encargado de metabolizar todas las sustancias extrañas que entran al cuerpo.

Otra barrera que hay que tomar en cuenta es la respuesta inmunogénica que puede ser activada por la molécula de ARN o por el transportador que se está usando, sobre todo si se quiere usar el agente terapéutico repetidas veces, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades crónicas. Un grupo de investigadores británicos desarrollaron un transportador basado en exosomas los cuales permiten llevar moléculas de ARN de silenciamiento (ARNsi) al tejido cerebral de manera específica y sin producir una respuesta inmunogénica según reportaron ayer en Nature Biotechnology.

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Los exosomas son pequeñas nanovesículas naturales secretadas por diferentes tipos de células, cuya función es transportar diferentes compuestos y moléculas señalizadoras de un lugar a otro, permitiendo la comunicación celular. Su tamaño varía entre 40 y 100nm y en los últimos años se ha investigado mucho sobre su uso como transportador específico de agentes terapéuticos. En el 2007, Valadi et al. demostraron que los exosomas pueden ser usados para transportar pequeñas moléculas de ARN.

Para que un exosoma sea específico para un determinado tejido debe tener en su superficie unas pequeñas moléculas llamadas ligandos, los cuales serán reconocidos por receptores específicos dependiendo del tejido. Estos ligandos son principalmente pequeñas secuencias de aminoácidos llamados péptidos.

De esta manera, Álvarez-Erviti et al. aislaron exosomas de la médula ósea de ratones, específicamente de las células dendríticas inmaduras. Los exosomas obtenidos tuvieron un tamaño homogéneo de 80nm de diámetro. Luego, se fusionaron a la superficie de los exosomas péptidos específicos para ser reconocidos por determinados receptores de las células musculares y cerebrales, dos tejidos que sufren de enfermedades degenerativas. Uno de los péptidos reconoce los receptores de acetil colina del sistema nervioso central llamado RVG, otro reconoce ciertos receptores de las células musculares llamado MSP y un tercero evidencia la presencia de los exosomas llamado FLAG-Lamp2b —para poderles hacer un seguimiento.

Una vez construido los exosomas con los ligandos específicos, el siguiente paso fue insertar el ARNsi. Para ello usaron una técnica muy usada para insertar fragmentos de ADN en bacterias y protoplastos llamado electroporación [Ver BioUnalm for Dummies #2]. Finalmente, una vez obtenidos los exosomas, con los péptidos específicos para los tejidos musculares y neuronales, y cargando la molécula de ARNsi, probaron si funcionaban en dos líneas celulares: del músculo murino (C2C12) y células neuronales (Neuro2A), que son específicos para los exosomas MSP y RVG, respectivamente. Los resultados de la PCR cuantitativa (determinación de la cantidad del ARNsi) y de la microscopia de fluorescencia (determinación de la unión de los exosomas a las líneas celulares específicas) confirmaron la eficiencia de la técnica in vitro.

Como la técnica funcionó, los investigadores quisieron probar un agente terapéutico contra el Alzheimer. Para ello diseñaron un ARNsi contra el gen BACE1, el cual codifica para una proteasa responsable de la formación de la proteína precursora amiloidea, que producen la formación de los agregados de β-amiloide. Cuando analizaron los niveles de BACE1, vieron que el tratamiento con los exosomas lo redujo significativamente. Además, los ensayos de toxicidad demostraron que el producto era inocuo lo que daría pie para hacer los ensayos in vivo.

Luego, se diseñaron exosomas portando un ARNsi para un gen que es expresado en todo momento (constitutivo), ya que codifica para la enzima necesaria del sexto paso de la glucólisis —la gliceraldéhído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH).  Primero se inyectaron exosomas libres (sin ligandos específicos) vía intravenosa en ratones de laboratorio y se analizaron los niveles de expresión de la GAPDH en los riñones, hígado y bazo. Como era de esperarse, los niveles de esta enzima se vieron afectados significativamente. Cuando se inyectaron los exosomas con los péptidos RVG se observó que los niveles de la enzima GAPDH se redujeron en el cerebro pero no en otros tejidos, quedando demostrada la especificidad de la técnica.
Además, determinaron que la readministración de los exosomas no reducía su especificidad y eficiencia. Para esto, inyectaron en los ratones exosomas RVG libres unas semanas antes de inyectar los exosomas con el ARNsi para la enzima GAPDH. Los resultados mostraron que hubo una mínima atenuación pero esta no era significativa, lo que demostraba el uso potencial de lo exosomas en el tratamiento de enfermedades crónicas.

Finalmente, probaron si los exosomas desarrollados durante el presente trabajo serían buenos agentes terapéuticos contra el gen BACE1, responsable del Alzheimer. Para ello usaron ratones modificados para expresar este gen en grandes cantidades y les insertaron lo exosomas portando el ARNsi para BACE1. Los resultados mostraron que la cantidad de ARN mensajero de BACE1 se redujo significativamente y hubo una inhibición de la función de una γ-secretasa, que también responsable de la formación de los β-amiloide. Además, al comparar los niveles de β-amiloide usando los exosomas terapéuticos y los inhibidores de BACE1 que actualmente se usan, la reducción fue mayor usando los primeros.

exosome

Por otro lado, los investigadores quisieron ver si los exosomas generaban algún tipo de respuesta antigénica, toxicidad u otro efecto secundario, para ello estudiaron las concentraciones de interleucina-6, IP-10, TNF-α y IFN-α. Los niveles fueron normales lo cual indica que los exosomas son seguros ya que no generan algún tipo de respuesta inmunogénica.

Este estudio se ve muy prometedor, quedaría ahora hacer unos estudios más cuidadosos en líneas celulares humanas, ver si son seguros para poder empezar con los primeros ensayos clínicos. Sin dudas, con esta tecnología se podría superar uno de los principales inconvenientes de la terapia génica, el transporte del agente terapéutico —en este caso un ácido nucléico— al tejido donde realizará su función, de manera específica.




Referencia:


ResearchBlogging.orgAlvarez-Erviti, L., Seow, Y., Yin, H., Betts, C., Lakhal, S., & Wood, M. (2011). Delivery of siRNA to the mouse brain by systemic injection of targeted exosomes Nature Biotechnology DOI: 10.1038/nbt.1807

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