23 agosto, 2010

Se purifica la proteína envuelta en el cáncer de mama

El gen de la proteína BRCA2 fue descubierto en 1994 y desde ese entonces fue asociado con el cáncer de mama ya que, mutaciones en este gen estaban relacionados con más del 50% de casos de cáncer de mama y ovarios. Fue así que se usó este gen como un marcador para hacer estudios de predisposición a este tipo de cáncer, en aquellas personas cuyos familiares padecieron esta enfermedad.

Sin embargo, tuvieron que pasar más de 15 años para que la proteína entera fuera purificada. [Ya mencionamos en un artículo pasado por qué es tan difícil purificar y determinar la estructura tridimensional de una proteína]. Los encargados de este trabajo fueron investigadores de la Universidad de California, Davis quienes publicaron sus descubrimientos en dos artículos de la revista Nature Structural & Molecular Biology. Las principal dificultad fue que la proteína era sumamente larga, y cuando una proteína es muy larga, la expresión y traducción del gen no es muy buena y su estructura tridimensional no puede ser mantenida estable por mucho tiempo, se degrada fácilmente.

Para recordar:  La proteína BRCA2 es conocida por su capacidad de reparar el ADN dañado; sin embargo, no se sabe como interactúa con las otras proteínas, la DSS1 y la RAD51 – que también son parte del sistema de reparación del ADN – para hacer su trabajo.

Aprovecharé este artículo para explicarles como se hace un trabajo de este tipo:

Primero, se debe expresar la proteína in vitro (en una placa petri), para eso debe insertarse el gen brca2 en una línea celular que pueda ser fácilmente cultivable. En el mercado existen muchas líneas celulares humanas a la venta, pero, no todas tienen las mismas características y el mismo comportamiento funcional; así que se debe probar la expresión del gen en diversas líneas celulares, encontrarla, puede ser una tesis de doctorado.

Una vez que lograron expresar correctamente toda la proteína en un cultivo celular, procedieron a purificarla. La manera tradicional de hacerlo es mediante procesos fisicoquímicos, precipitación de la proteína con sulfato de amonio, resuspensión en una solución adecuada para que no pierda su estructura terciaria, separarla a través de columnas cromatográficas y, finalmente, cristalizarlas. Pero, como la proteína es tan grande, los métodos tradicionales difícilmente puedan funcionar, así que ahora existen kits que te permiten hacer este trabajo de manera más sencilla, se basan en los mismos principios tradicionales, con soluciones más sofisticadas, columnas más selectivas y el uso de enzimas como las chaperonas que protegen a la proteína, manteniéndolas en estados más estables, luego las separan de las proteínas que están siendo purificadas usando peptidasas selectivas y así obtienen la proteína pura. Sin embargo, los kits no te garantizan que la proteína sea purificada, ya que cada proteína es única, con su propia estructura tridimensional y sus propias características bioquímicas. Una vez purificada y cristalizada, se procede a determinar su estructura tridimensional mediante difracción de rayos X [También explicado en el artículo pasado].

Durante el estudio, los investigadores encontraron que la pequeña proteína, DSS1, estimulaba a la BRCA2 para que se ensamble al complejo RAD51/ADN, así que purificaron tanto a la BRCA2 como a la DSS1 juntas para ver como era su interacción. Usaron como línea celular una levadura para insertar y expresar expresar los genes brca2 y dss1.

Ahora, sólo faltaba determinar como era la asociación de BRCA2 y RAD51. Los investigadores encontraron que la proteína la BRCA2 se podía unir hasta con seis RAD51, gracias a la ayuda de la DSS1, y una vez formado este complejo, tenían una alta afinidad por el ADN de hebra simple, el cual está protegido por la proteína RPA. La BRCA2 tiene la capacidad de detectar las mutaciones mientras que la RAD51 es la que tiene la actividad recombinasa, o sea, la que hace la reparación en sí mediante recombinación homóloga. Estas observaciones las hicieron bajo el microscopio electrónico.

 

Entonces, como esta relacionado BRCA2 con el desarrollo del cáncer de mama? Bueno, si BRCA2 está mutado, no reconocerá eficientemente el ADN dañado y se empezará a acumular hasta que genere una célula cancerígena que se empezará a dividir sin control hasta generar un tumor y migrar hacia otros tejidos (metástasis) para generar nuevos tumores.

Gracias a este estudio se puede entender mejor como se da este complicado proceso, como interactúan las proteínas involucradas y de que formas se podría rescatar a una BRCA2 mutada. También debemos recordar que mutaciones en la proteína BRCA2 están envueltas en el 50% de los casos de cáncer de mama y ovarios, el otro 50% se deben a muchos otros factores más, muchos de ellos aún desconocidos.

Referencias:

Nature Structural & Molecular Biology. DOI:10.1038/nsmb.1904

Nature Structural & Molecular Biology. DOI:10.1038/nsmb.1905

Ojo: Las imágenes son modelos hechos antes de estos estudios, no cumplen con algunas de las cosas que hemos mencionado; sin embargo, son muy didácticas por eso las usé.

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