26 marzo, 2010

Una nueva estrategia para producir plantas haploides

Producir plantas haploides viables es uno de los santos griales del fitomejoramiento y la biotecnología vegetal. ¿Por qué? Porque lo que un fitomejorador quiere es que una vez que consiga una planta con un alto rendimiento, que resista enfermedades o sequías o que no tenga muchos requerimientos nutricionales, esta siga una línea homocigota. Esto quiere decir que sólo tenga un determinado alelo para cada gen, de esta manera, al auto-fertilizarla o cruzarla con otra planta similar, estas características adquiridas no se pierdan.

De manera más sencilla:

Recordemos que una mitad de los genes son de la madre y la otra mitad del padre. Digamos que los genes de la madre  le dan un buen rendimiento a la planta pero no soportan las sequías (AAbb), mientras que los genes del padre no tienen buen rendimiento pero soportan muy bien las sequías (aaBB). Lo que buscaremos es cruzar estas dos plantas para obtener una planta con alto rendimiento y que soporte la sequías (AAbbXaaBB). Así que después de algunos meses por fin obtenemos la planta deseada (AaBb). Pero, como la planta tiene la mitad de los genes del padre y la otra mitad de la madre, será heterocigota (tiene los genes buenos y también los genes malos, pero los como buenos son dominantes, se expresan) así que al auto-fertilizarla (AaBbXAaBb) sólo un 25% de las plantas tendrán solo los genes buenos (AABB).

 

Entonces, lo ideal sería hacer que la planta se quede con un sólo juego de genes (los buenos) y eliminar los malos (ab) para recién auto-fertilizarla. Para esto debemos reducir su carga genética a la mitad, volverlas haploides (AB). Pero las plantas necesitan de los dos juegos (diploides) para poder vivir, así que debemos diseñar un método para producir plantas haploides viables, que posteriormente se puedan volver nuevamente diploides (AABB), se puedan cruzar o auto-fertilizar (AABBXAABB) para generar semillas viables homocigotas (AABB).

¿Se ve sencillo no? Pero no es así. Estas características no están gobernadas solo por dos genes (AB) con dos alelos (A, a, B, b), son muchos los genes y alelos que gobiernan estas características (A1, A2, A3,…B1, B2, B3,… C1, C2, C3,… D1… E… F…), así que obtener la planta deseada se hace demasiado tedioso, con muchos años de cruzas, retrocruzas y auto-fertilizaciones. Así que, porque no desarrollar una técnica que primero parta en la mitad los genes (AaB1B2CcDdEEF1F3 [diploide] –> AB2CDEF3 y aB1cdEF1 [haploides]) para luego regenerar la diploidía (AAB2B2CCDDEEF3F3 y aaB1B1ccddEEF1F1), todos homocigotas. ¿Cuanto tiempo ahorraría esto?

ResearchBlogging.orgPor suerte hasta ahora habían dos métodos —no muy buenos— usados para volver haploides a las plantas. El primero era cultivar gametofitos (células sexuales, haploides) en medios de cultivo especiales para regenerar plantas diploides homocigotas; lamentablemente, muchas especies son recalcitrantes a este proceso. La segunda opción era hacer cruces inter-específicos (cruzar una especie con otra diferente) en el cual el genoma de uno de los parentales es eliminado; pero la base molecular de este proceso de eliminación genómica aún no se entiende.

No olvidemos que hay un proceso natural para generar células haploides: la meiosis. Si nos ponemos a pensar un rato en la división celular, tanto en la mitosis como en la meiosis las cromosomas migran a través del huso acromático. Estos microtúbulos se unen a un lugar específico de los cromosomas para jalarlos a un determinado polo para formar el material genético de cada una de las células hijas, esta zona es conocida como el centrómero. Los centrómeros son reconocidos específicamente por un tipo de histona, la CENH3 en Arabidopsis thaliana (una variable de la histona tipo H3), la cual es necesaria para una buena migración de los cromosomas por el huso acromático.

El mutante cenh3-1 fue aislado. Este mutante provoca la muerte del embrión, pero si está presente un CEHN3 sano complementario (dominante), la planta expresa un fenotipo silvestre (normal). Entonces, este mutante debe tener algún efecto en la migración de los cromosomas para causar la muerte del embrión, por qué no aprovecharlo de alguna manera para generar plantas haploides.

tailswap Se diseñó una planta GFP-tailswap, una planta con el gen mutante cenh3-1 rescatado por una CENH3 modificada unida a la proteína verde fluorescente (proteína que brilla de color verde bajo las luz UV) para ubicar la histona. Esta planta no tiene problemas al realizar la mitosis pero son estériles al llegar la floración. Esto quiere decir que se ha visto afectada la producción de los gametos, en otras palabras, ha fallado algo en la meiosis.

Cuando la planta GFP-tailswap es polinizada por una planta silvestre, entre el 80 y el 95% de los óvulos fertilizados son abortados. Se esperaba que la descendencia viable fueran heterocigotas para cenh3-1 y hemicigota para GFP-tailswap, pero 10 de las 16 plantas viables solo tenían el gen CERH3 y no el GFP-tailswap. Pero, a pesar que tenían el genotipo silvestre eran estériles. ¿Por qué? Un estudio posterior reveló que eran haploides!

Si no se han perdido… que quiere decir esto? Sólo permaneció el genoma del parental silvestre mientras que el genoma del parental GFP-tailswap se perdió. Por fin se pudo crear una planta haploide, y sólo del parental silvestre. Si en vez de ese parental silvestre usamos una parental con genes excelentes, podremos obtener un haploide sólo con los genes excelentes, justo lo que estamos buscando!

La explicación de esto es que hay una perturbación en la estructura del centrómero que impide la segregación de los cromosomas en la mitosis zigótica creando un embrión haploide. Al analizar el ADN plastídico se observó que el citoplasma siempre era materno. Por esta razón cuando se cruza un tipo silvestre como madre y un GFP-tailswap como padre, la proporción de haploides es menor a que si fuera al revés. Esto porque el CERH3 presente en la madre, se expresa más tempranamente que el mutante del padre, uniéndose a los cromosomas antes que el mutante, generando diploides. Si es el mutante la madre, expresará primero el gen mutante cenh3-1 y se unirá a los cromosomas antes que el CERH3, evitando la segregación de los cromosomas, generando haploides. Los diploides y los haploides son morfológicamente similares, simplemente los haploides son ligeramente más pequeños.

cerh3

Pero para explotar el potencial de los haploides, hay que generar diploides fértiles. Una pequeña minoría de los haploides, todos los cromosomas segregan a una de las células hijas en la Anafase I y luego las cromátides hermanas se separan en la meiosis II, generando gametos haploides (tétradas haploides). Estos pueden auto-fertilizarse generando diploides homocigóticos. También se han observado raros episodios, donde las células somáticas (tallos) se vuelven diploides espontáneamente. También se puede hacer el uso de la colchicina para regenerar los diploides.

Muchos cultivos comerciales son poliploides, esto dificulta más aún los programas de fitomejoramiento. También se ha probado esta técnica para reducir la ploidía de estas especies.

Para ir más allá de este descubrimiento, no sólo se podría usar al mutante cenh3-1 para generar haploides, también se podría usar ARN de interferencia para silenciar (reducir o eliminar) la función endógena del CERH3. En el maíz se ha podido inducir la haploidía usando al gen indeterminate gametophyte (ig), lamentablemente su ortólogo en A. thaliana no pudo copiar este efecto. Pero esta técnica del mutante cenh3-1 fácilmente se podría extrapolar a otras especies, además presenta muchas ventajas como: no requiere de medios de cultivo sofisticados, se puede producir tanto haploides maternos como paternos, se puede poner el genoma de un parental en el citoplasma de otro parental y la eliminación del genoma ocurre entre parentales que son isogénicos excepto a las alteraciones de CERH3, evitando las barreras de fertilidad entre amplios cruces.

Referencia:

Ravi, M., & Chan, S. (2010). Haploid plants produced by centromere-mediated genome elimination Nature, 464 (7288), 615-618 DOI: 10.1038/nature08842

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