30 junio, 2008

Igual pero diferente

Como todos sabemos, nuestro código genético es degenerado, aunque yo prefiero decirle "redundante", osea un aminoácido puede estar codificado por más de un triplete. Una proteína promedio de unos 300 aminoácidos, puede estar codificada de 10 a la 151 formas (un 1 y 151 ceros¡¡¡¡¡). Esto obviamente no se da en las células, lo que pasa es que hay ciertos codones que son usados con una mayor frecuencia que otros. Ej. Para la Alanina, el codon GCC es usado 4 veces más que el codón GCG.

Pero existe otra cosa curiosa, un par Ala-Glu se esperría que sea expresado de la forma GCCGAA o GCAGAG con la misma frecuencia, pero esto no se da, es más la forma GCCGAA, es expresada 7 veces menos que la forma GCAGAG, a pesar que GCC es la forma más común de Ala. Pero porque suele ocurrir esto? Estas interrogantes han conducido a investigar porque determinados pares de tripletes son más frecuentes que otros.

Para llevar a cabo este estudio se usó el virus de la Polio (PV: Poliovirus) que fue sintetizado de novo cargando la misma secuencia de aminoácidos que la especie silvestre pero usando codones diferentes. Los aminoácidos se tomaron en pares, y usando un algoritmo de computadora creado para este estudio, se determinó la frecuencia de expresión de cada par de tripletes que codificaban para un mismo par de aminoácidos. Se crearon 2 PV, uno cargando los pares de codones que se expresaban con mayor frecuencia (PVmax) y otro que cargaba los pares de codones que se expresaban con menor frecuencia (PVmin). PVmax y PVmin codificaban la misma secuencia de aminóacidos que la especie silvestre de la región P1 del genoma del virus (formadora del precursor de la cápside del virus). Se usó células HeLa R19 que fueron infectadas con el virus para su producción.

Lo primero que se encontró fue que tanto PVwt como PVmax mostraban casi el mismo efecto citopático después de 24 horas, encambio PVmin no mostraba efecto alguno después de 96 horas. Para salvar este defecto, se crearon diferentes subgrupos de PVmin, con regiones de PVwt para disminuir la cantidad de codones expresados con baja frecuencia. Con esto se pudo determinar que cuanto más codones de baja expresión posee el PV, el nivel de atenuación es mayor, y su cinética de crecimiento disminuye, tanto en Unidades Formadoras de Placa (PFU) que es 1000 veces menor, como en cantidad de partículas (viriones) producidas siendo 10 veces menor. Esto quiere decir que además las viriones producidos tienen una menor eficiencia produciendo un efecto citopático, osea son menos virulentas. La termoestabilidad de PVminXY y PVminZ fue similar al PVwt, comprobando que esta atenuación no se debe a un defecto en la formación de la cápside.

Solo faltaba una cosa más por determinar, el efecto de los pares de codones en la traducción. Para esto se usó un reportero dicistrónico, R-Luc y F-Luc. El reportero F-Luc fue fusionado a las proteínas codificadas por la región P1, de esta manera el reportero sera expresado proporcionalmente a las proteínas de la region P1. El reportero R-Luc esta ubicado en la región de reconocimiento del Ribosoma, de esta manera la división entre la cantidad de luminiscencia emitida por F-Luc entre R-Luc nos dará la eficiencia de la traducción (translatability). PVminXY, PVminZ, PVmin producen menos F-Luc por unidad de R-Luc expresada. A diferencia de PVmax que expresa más F-Luc por unidad de R-Luc por lo tanto la traducción ha sido potenciada.

Finalmente se determinó si estos virus sintéticos eran atenuados en animales, para esto se les inyecto a ratas de laboratorio al virus directamente al sistema nervioso central. PVminXY y PVminZ fueron atenuados tal como en las células HeLa R19, la virulencia de PVmax fue identica que la de PVwt. Como PVminXY y PVminZ codifican exactamente para la misma proteína que PVwt provocan una respuesta inmune protectora, por esta razón este mecanismo esta siendo estudiado a fondo para la producción de nuevas vacunas usando virus viables pero con modificaciones en su secuencia de codones para atenuar su efecto infeccioso.
Referencia

Virus Attenuation by Genome-Scale Changes in Codon Pair Bias J. Robert Coleman, Dimitris Papamichail, Steven Skiena, Bruce Futcher, Eckard Wimmer, Steffen Mueller Science 27 June 2008:Vol. 320. no. 5884, pp. 1784 - 1787 DOI: 10.1126/science.1155761

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